بررسی بیوشیمیایی و ژنتیکی نانوذرات نقره بر روی گیاه گوجه فرنگی

فهرست
1- کلیات 3
1-1 نانوتکنولوژِی 3
1-2 تاریخچه ی نانو فناوری، نقره و نانوذرات نقره 4
1-3 نانو ذرات نقره 5
1-3-1 ویژگی های منحصر به فرد نانو ذرات نقره 5
1-3-2 اثرات مخرب نانوذرات نقره بر محیط زیست و اکوسیستم 6
1-4 سازوکار سمیت فلزات سنگین در گیاهان 6
1-4-1 روش غیر مستقیم 6
1-4-2 روش مستقیم با تخریب ساختار سلول 6
1-5 روش پاكسازي آلودگي خاك 7
1-6 مكانيسم هاي مقاومت به فلزات سنگين در گياهان 8
1-7 مكانيسم هاي سلولي مقاومت به فلزات سنگين 8
1-8 نقش آمينو اسيدها در گياهان 9
1-8-1 سنتز پروتئین‌ها 9
1-8-2 ایجاد مقاومت در برابر تنش‌های محیطی 9
1-8-3 تاثیر بر روی فتوسنتز و رشد گیاه 10
1-8-4 تاثیر بر روی عمل روزنه‌ها 10
1-8-5 خاصیت کلات کنندگی عناصر 11
1-8-6 آمینو اسیدها و هورمون‌های گیاهی 11
1-8-7 تاثیر بر گرده افشانی و تشکیل میوه 11
1-8-8 کمک به تعادل میکروفلورای خاک 11
1-9 استفاده از HPLC و تاریخچه استفاده از کروماتوگرافی 12
1-9-1 کاربردها 12
1-9-2 دستگاه HPLC 13
1-9-3 حلالها در HPLC 14
1-9-4 موتور يا پمپ 15
1-9-5 انجکتر injector 16
1-9-6 ستون 16
1-9-7 آشكارساز(Detector) 17
1-9-8 ارزيابي داده های دستگاه HPLC 18
1-9-9 شروع كار با دستگاه 18
1-10 گیاه گوجه‌فرنگی 19
1-10-1 گیاه شناسی گوجه فرنگی Lycopersicon esculentum mill)). 19
1-10-2 ویژگی های پزشکی گوجه فرنگی 19
1-10-3 ترکیبات موجود در گوجه فرنگی 21
1-11 اهداف تحقیق 21
2- مواد و روش ها 23
2-1 شرایط و نحوه کشت 23
2-2 سنتز نانوذره استفاده شده 24
2-2-1 استفاده از نانوذرات آماده با اندازه 20 نانومتر خریداری شده از شرکت (Us nano research) 25
2-3 اعمال تیمار 27
2-4 برداشت و نگهداري 28
2-5 اندازه گیري طول ریشه و ساقه 28
2-6 اندازه گیري وزن تر وخشک ریشه، ساقه و برگ 28
2-7 اندازه گیري رنگیزه هاي کلروفیل و کاروتنوئید 28
2-8 تعیین میزان فنل کل 29
2-9 سنجش محتواي نیترات 29
2-10 اندازه گیری قند های محلول 30
2-11 اندازه گیری مقدار پروتئین محلول 30
2-12 سنجش و اندازه گیری میزان اسید های آمینه آزاد با استفاده ازHPLC 32
2-12-1 مراحل تهيه محلولهاي مورد نياز جهت سنجش مقدار كمي پروفايل اسيدهاي آمينه با استفاده از روش مشتق سازی OPA 32
2-12-2 اينترنال استاندارد 33
2-12-3 مراحل تهیه ی بافر های دستگاه HPLC 34
2-13 آماده سازی نمونه ها برای کارهای ژنتیکی 35
2-13-1 ریشه دار کردن بذرها 35
2-13-2 پیش تیمار 35
2-13-3 تثبیت 36
2-13-4 نگهداری 36
2-13-5 هیدرولیز 36
2-13-6 رنگ آمیزی 36
2-13-7 اسکواش کردن 37
2-13-8 مطالعه میکروسکوپی 37
2-14 آنالیز آماری 38
3- نتایج 40
3-1 اثر غلظت های مختلف نانوذرات نقره بر تعداد برگ ها 40
3-2 اثر غلظت های مختلف نانوذرات نقره بر اندازه اندام های هوایی 40
3-3 اثر غلظت های مختلف نانوذرات نقره بر اندازه ریشه 42
3-4 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوای نقره جذب شده توسط گیاه 42
3-5 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوای کلروفیلa ، کلروفیل b و کاروتنوئید ها 43
3-6 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر وزن تر گیاه 44
3-7 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوای فنل کل 45
3-8 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوای نیترات اندام هوایی گیاه 45
3-9 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوای نیترات ریشه گیاه 46
3-10 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوی قند محلول گیاه 47
3-11 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوای پروتئین محلول گیاه 48
3-12 سنجش و اندازه گیری میزان اسید های آمینه با استفاده ازHPLC 48
3-12-1 آنالیز داده‌های حاصل از گراف‌های دستگاه HPLC در غلظت‌های مختلف نانو ذرات نقره 48
3-12-2 کروماتوگرام وگراف‌خام حاصل از دستگاه HPLC مربوط به گروه کنترل 58
3-12-3 کروماتوگرام وگراف‌ خام حاصل از دستگاه HPLC مربوط به غلظت 25 میلی گرم بر لیتر 58
3-12-4 کروماتوگرام وگراف خام حاصل از دستگاه HPLC مربوط به غلظت 50 میلی گرم بر لیتر 59
3-12-5 کروماتوگرام وگراف خام حاصل از دستگاه HPLC مربوط به غلظت 100 میلی گرم بر لیتر 59
3-13 بررسی های ژنتیکی 60
3-13-1 شمارش سلول‌ها 60
3-13-2 نتایج مطالعات رنگ‌آمیزی 61
4- بحث 70
4-1 رشد ریشه و اندام هوایی 71
4-2 محتوی فنل 72
4-3 محتوای نیترات 75
4-4 محتوی قند محلول 76
4-5 پروتئین محلول 76
4-6 اسید های آمینه 78
4-7 ناهنجاریهای ژنتیکی 80
4-8 نتیجه‌گیری 81
4-9 پیشنهادات 82
5- پیوست 85
6- منابع 87
فهرست نمودارها
نمودار ‏31 اثر غلظت های مختلف نانوذرات نقره بر تعداد برگ ها. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است. P<0.05)) 40
نمودار ‏32 اثر غلظت های مختلف نانوذرات نقره بر اندازه اندام های هوایی. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است P<0.05)). 41
نمودار ‏33 اثر غلظت های مختلف نانوذرات نقره بر اندازه ریشه. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است 42
نمودار ‏34 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوی نقره جذب شده توسط گیاه. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است. P<0.05)) 43
نمودار ‏35 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوی کلروفیلa ، کلروفیل b و کاروتنوئید ها. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده استP<0.05) ). 44
نمودار ‏36 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر وزن تر گیاه. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است P<0.05)). 44
نمودار ‏37 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوی فنل کل. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است. P<0.05)) 45
نمودار ‏38 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوی نیترات اندام هوایی گیاه. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است P<0.05)). 46
نمودار ‏39 بررسی اثر غلظت های ممختلف نانو ذرات نقره بر محتوی نیترات ریشه گیاه. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است.P<0.05)). 47
نمودار ‏310 بررسی اثر غلظت های مختلف نانو ذرات نقره بر محتوی قند محلول گیاه. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است.P<0.01)). 47
نمودار ‏311 بررسی اثر غلظت های متفاوت نانو ذرات نقره بر محتوی پروتئین محلول گیاه. . داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان شده است. 48
نمودار ‏312 اسید آمینه آسپارژین 49
نمودار ‏313 اسید آمینه گلوتامین 50
نمودار ‏314 اسید آمینه گلوتامیک اسید 50
نمودار ‏315 اسید آمینه آسپارتیک اسید 51
نمودار ‏316 اسید آمینه سیستئین 51
نمودار ‏317 اسید آمینه هیستیدین 52
نمودار ‏318 اسید آمینه الانین 52
نمودار ‏319 اسید آمینه متیونین 53
نمودار ‏320 اسید آمینه تیروزین 53
نمودار ‏321 اسید آمینه والین 54
نمودار ‏322 اسید آمینه پرولین 55
نمودار ‏323 اسید آمینه ایزولوسین 55
نمودار ‏324 اسید آمینه فنیل آ لانین 56
نمودار ‏325 اسیدآمینه سرین 56
نمودار ‏326 اسید آمینه ترپتوفان 57
نمودار ‏327 اسید آمینه لو سین 57
هرست شکل ها
شکل ‏11 دستگاه HPLC 14
شکل ‏12 موتور یا پمپ دستگاه HPLC 16
شکل ‏13 دتکتور ماورای بنفش 17
شکل ‏21 گیاهچه های گوجه فرنگی (یک هفته بعد از انتقال به محلول غذایی هوگلند) 24
شکل ‏22 اسکن میکروسکوپ الکترونی از نانوذره استفاده شده scan electronic microscopy)) SEM. 27
شکل ‏23 الگوی پراش پرتو x (X ray pattern) از نانوذره استفاده شده. 27
شکل ‏31 تصویر گیاهان تیمار شده با غلظت های مختلف نانوذرات نقره، سیر نزولی رشد با افزایش دوز نانوذره نقره.گیاهان تیمار ساقه خشبی و مربع شکل دارند،برگها نسبت به گروه کنترل کوچکتر و پیچ خورده اند 41
شکل ‏32 سلول‌ها با هسته‌ی طبیعی مربوط به گروه کنترل. بزرگنمایی(x 3000) 61
شکل ‏33 الف) سلول های با کروموزومهای طبیعی در مرحله پرو متافاز بزرگنمایی(x 4000) 62
شکل ‏34 ب) سلول های با کروموزومهای طبیعی در مرحله پرو متافاز بزرگنمایی(x 1600) 62
شکل ‏35 الف) سلول با هسته های غیر طبیعی ،سلول دارای هسته و هستک بزرگنمایی(x 3000) 63
شکل ‏36 لکه های سیاه رنگ نانوذرات نقره جذب شده در سلول ها را نشان میدهد (دوز 100 میلی گرم بر لیتر مدت زمان تیمار 4 ساعت). بزرگنمایی(x 1600) 64
شکل ‏37 ب) شکست هسته و تولید ریز هسته ها (دوز 75 میلی گرم بر لیتر) بزرگنمایی(x 3000) 65
شکل ‏38 ناهنجاری هایی از نوع پل های کروموزومی،کروموزوم حلقوی و متافاز تاخیری و شکستگی کروموزومی را می توان مشاهده کرد. دوز 50 میلی گرم بر لیتر بزرگنمایی (x 3000). 66
شکل ‏39 پل های کروموزومی که نشان از به هم چسبیدن کروموزوم ها است (دوز 25 میلی گرم بر لیتر بزرگنمایی x 3000). 67
شکل ‏310 متافاز به هم ریخته همراه با شکست های کروموزومی متعدد که سبب شده تعداد کروموزوم ها از 24 عدد بیشتر شود. 67
شکل ‏41 واکنش فنل با گونه های فعال اکسیژن 73
شکل ‏42 تولید ترکیبات فنلی در گیاهان در شرایط تنش از مسیر شیکیمیک اسید 74
شکل ‏43 مسیر های بیوسنتز اسید های آمینه و متابولیتهای نیتروژنی وابسته به فلزات سنگین 79
فهرست کروماتوگرام ها
کروماتوگرام ‏31 گروه کنترل 58
کروماتوگرام ‏3225 میلی گرم بر لیتر 58
کروماتوگرام ‏3350 میلی گرم بر لیتر 59
کروماتوگرام ‏34100 میلی گرم بر لیتر 59
فهرست جداول
جدول ‏11 مواد غذایی موجود در هر 100 گرم گوجه فرنگی ( پایگاه اطلاعاتی مواد غذایی آمریکا) 21
جدول ‏31 شمارش سلول‌ها 60
هرست پیوست ها
پیوست ‏51 منحنی استاندارد فنل کل 85
پیوست ‏52 منحنی استاندارد نیترات 85
پیوست ‏53 منحنی استاندارد قند محلول 86
پیوست ‏54 منحنی استاندارد پروتئین محلول 86
چکیده
امروزه نانوذرات نقره به دلیل خاصیت آنتی باکتریالی شان به طور گسترده ای در صنایع گوناگون مورد استفاده قرار میگیرند، از این رو امکان ورود پسماندهایی از این مواد در محیط زیست وجود دارد و عدم اطلاع از اثرات نامطلوب آنها از جمله خطراتی است که می تواند محیط زیست را تحت تاثیر قرار دهد. در این تحقیق به بررسی اثرات بیوشیمیایی و ژنتیکی نانوذرات نقره بر روی گیاه گوجه فرنگی که از جمله پر مصرف ترین سبزیجات در سبد غذایی همه ی افراد در سراسر دنیاست پرداخته شده است. در این تحقیق پس از خزانه گیری، گیاهچه ها ی دوبرگی به گلدانهای حاوی محلول های غذایی هوگلند انتقال داده شدند. دوهفته پس از انتقال گیاهچه ها به محیط هوگلند ودر مرحله ی 5 برگ گسترده گیاهان به طور تصادفی به پنج گروه تقسیم شدند و هرگروه دوزهای (0,25, 50, 75, 100) میلی گرم برلیتر نانوذره نقره را در طی 20 روز دریافت کردند . آزمایش در قالب پنج تکرار انجام شد. آنالیز نتایج کاهش میزان رشد و رنگیزه های گیاه، کاهش میزان پروتئین محلول ، محتوی نیترات و قند های محلول وهمچنین افزایش میزان اسیدهای آمینه، محتوی فنلی گیاه و افزایش جذب نقره در دوزهای بالای استفاده شده را نشان داد. این فاکتور ها بیانگر ایجاد استرس اکسیداتیو ایجاد شده در گیاه به وسیله نانوذرات نقره است. همچنین کاهش شدید ثابت میتوزی وافزایش ناهنجاریهای ژنتیکی در مریستم های راس ریشه در گیاهچه های تیمار شده با نانوذرات نقره مشاهده گردید.نانوذرات نقره با ایجاد استرس اکسیداتیو در گیاه و داشتن اثرات سمیتی بر روی محتوی ذخیره ای DNA و اختلال در تقسیم سلولی نرمال باعث ایجاد گیاهان غیرطبیعی می‌گردد.
واژه های کلیدی: نانوذرات نقره، گوجه فرنگی، اثرات بیوشیمیایی، اسید های آمینه آزاد، ناهنجاری کروموزومی، ثابت میتوزی
فصل اول
کلیات
کلیات
نانوتکنولوژِی
نانو نه یک ماده است نه یک جسم، فقط یک مقیاس است. از نگاه لغوی، کلمه نانو به معنای یک میلیاردم متر (9-10) است و در اصل از یک واژه یونانی به معنای کوتوله گرفته شده است (رحمانی و همکاران، 1388). واژه فناوري نانو اولين بار توسط نوريوتاينگوچي استاد دانشگاه علوم توكيو در سال 1974 بر زبانها جاري شد، و برای اولین بار در زمینه ی الکترونیک برای کوچک سازی وسایل و ابزار های الکترونیکی پیشنهاد شد. در مقیاس نانو خواص فیزیکی، شیمیایی وبیولوژیکی تک تک اتم ها، مولکول ها باخواص توده ماده متفاوت است، نانوذرات درچنین مقیاس و مشخصه های منحصر به فردی موجب پیدایش دستاوردهای نوینی درعلوم پزشکی و مهندسی می شوند.