ارزیابی مقایسه ای اثر عصاره های گیاهی استاندارد تجاری آقطی سیاه، سرخارگل و داروی آمانتادین بر دفع ویروس آنفلوآنزای H9N2 در جوجه های گوشتی و میزان ويرو

پژوهش های پیشین نشاندهنده اثر ضد ویروسی فراورده های تهیه شده از گیاه سرخارگل و میوه آقطی سیاه بر ویروس های انسانی جنس A و B در محیط کشت سلولی و در شرایط in vitro می باشند. در این تحقیق اثر ضد ویروسی دو عصاره استاندارد شده تجاری Echinacea purpurea (EF) و Sambucus nigra (SAM) در مقایسه با داروی آمانتادین بر ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 در شرایط in vivo و in vitro بررسی شده است. برای مطالعه اثربخشی EF, SAMو آمانتادین در شرایط in vivo ، این سه ماده به مدت 7 روز از 8 ساعت پس از چالش با ویروس، از طریق تلقیح به داخل بینی، به آب آشامیدنی جوجه های ماکیان مورد آزمایش در گروه های مختلف درمان افزوده شد. در گروه پروفیلاکسی EF، عصاره به مدت 10 روز از 5 روز پیش از چالش با ویروس مورد استفاده قرار گرفت. در طی روزهای پس از چالش (PI)، تیتر ویروس در مخاط نای و مدفوع با آزمایش PCR زمان حقیقی مورد ارزیابی کیفی و کمی قرار گرفت. به منظور ارزیابی اثر مستقیم ضد ویروسی عصاره ها در شرایط in vitro ، ویروس مخلوط و انکوبه شده با عصاره ها به داخل کیسه آلانتوییک تخم مرغ های جنین دار تلقیح گردید. پس از 48 ساعت انکوباسیون، اثر عصاره درغیرفعال کردن ویروس با روش Neutralization Index (NI) بر مبنای Embryo Infective Dose 50(EID50) از لحاظ کیفی و با آزمایش PCR زمان حقیقی و هماگلوتیناسیون از لحاظ کمی بررسی شد. در نتایج بخش in vivo پژوهش، بالاترین تیتر ویروس در مدفوع و نای گروه کنترل چالش بدون درمان در روز 3 پس از چالش مشاهده شد. در مقایسه با گروه کنترل و سایر گروه های درمان، تجویز پروفیلاکسی EF سبب کاهش مشخص تیتر مدفوعی ویروس گردید. اگرچه تعداد کلی ویروس در نمونه های نای کم بود، درمان با آمانتادین و SAM منجر به کاهش تعداد نمونه های مثبت در مقایسه با گروه کنترل و گروه های درمان و پروفیلاکسی EF شد. نتایج بخش in vitro نشانگر اثر ضد ویروسی قابل توجه هر دو عصاره با NI>7.7 می باشد (NI>2.7 مثبت در نظر گرفته شد). همچنین، اندازه گیری تیتر ویروس در مایع آلانتوییک با آزمایش PCR زمان حقیقی و هماگلوتیناسیون نشاندهنده غیر فعال شدن معنا دار ویروس بر مبنای دوز عصاره است (P<0.05). نتیجه گیری این که مصرف این دو عصاره سبب کاهش دفع ویروس از پرندگان چالش شده با ویروس به ویژه در حالت پروفیلاکسی می گردد. نتایج in vitro اثر ضد ویروسی قابل توجه عصاره های مورد آزمایش را در غیر فعال کردن مستقیم ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 نشان می دهد. کلید واژگان: آنفلوانزا H9، سرخارگل، آقطی سیاه فهرست مطالب عنوان صفحه فصل اول: مقدمه و هدف 2 فصل دوم: کلیات 2-1- آنفلوانزا 5 2-1-1- تاریخچه همه گیری های آنفلوانزای خفیف پرندگان در اثر تحت تیپH9N2 5 2-1-2- اهمیت بیماری از نظر بهداشت عمومی 7 2-1-2-1- انتقال ژنوم کامل ویروس آنفلوانزای پرندگان 7 2-1-2-2- انتقال قطعات ژن ویروس آنفلوانزای پرندگان 9 2-1-2-3- انتقال ویروس H9 N2 به انسان 10 2-1-3- اهمیت اقتصادی بیماری 11 2-1-4- سبب شناسی بیماری 13 2-1-4-1- ریخت شناسی ویروس های آنفلوانزا 13 2-1-4-1-1- تفاوت های ساختاری ویروس های آنفلوانزای A، BوC 15 2-1-4-1-2- ویروس های آنفلوانزای 16 2-1-4-1-3- ساختار شیمیایی 17 2-1-4-1-4- ژنتیک 18 2-1-4-1-5- ژنوم ویروس 18 2-1-4-1-6- تفاوت های آنتی ژنی سویه ها (آنتی ژنیک دریفت و آنتی ژنیک شیفت ) 20 2-1-4-1-7- پروتئین های ویروس 21 2-1-4-2- تکثیر ویروس 25 عنوان صفحه 2-1-4-3- حساسیت ویروس به مواد شیمیایی و عوامل فیزیکی 26 2-1-4-3-1- شرایط آزمایشگاهی 27 2-1-4-3-2- شرایط مزرعه 28 2-1-4-4- ميزبان هاي ويروس آنفلوانزا 29 2-1-4-4-1- ميزبان هاي آزمايشگاهي 29 2-1-4-4-2- ميزبان هاي طبيعي 30 2-1-4-5- پاتوتیپ 32 2-1-4-6- بیماریزایی 34 2-1-4-6-1- گروه هاي کلينيکي در مزرعه 34 2-1-4-6-2- مراحل ایجاد عفونت 36 2-1-4-6-3- تاثير پروتئين هماگلوتنين بر بیماریزایی 37 2-1-4-6-4- مکانيسم پاتوبيولوژي سلولي 39 2-1-5- پاتولوژی 40 2-1-5-1- دوره کمون 40 2-1-5-2- نشانه هاي باليني بيماري 41 2-1-5-3- علائم کالبد گشایی 44 2-1-5-4- جراحات ریز بینی 45 2-1-5-5- ایمنی 46 2-1-5-5-1- ایمنی زایی 46 2-1-5-5-2- ایمنی فعال 47 2-1-5-5-3-ایمنی غیر فعال 48 2-1-6- تشخیص 48 2-1-6-1- جمع آوری و نگهداری نمونه ها 49 2-1-6-1-1- جمع آوری نمونه های سواب 50 عنوان صفحه 2-1-6-1-2- جمع آوری نمونه های بافتی 51 2-1-6-1-3- جمع آوری سرم 51 2-1-6-2- جداسازی و تشخیص ویروس آنفلوانزا 52 2-1-6-3- سرولوژی 54 2-1-6-4- تشخیص تفریقی 55 2-1-6-5- تشخیص مستقیم پروتئین ها یا اسید های نوکلئیک ویروس آنفلوانزا 56 2-1-5-5-1- تشخیص مولکولی ویروس آنفلوانزای پرندگان 57 2-1-6-5-1-1- واکنش زنجیره ای پلی مراز ( ) 57 2-1-6-5-1-2- واکنش زنجیره ای پلی مراز زمان حقیقی 59 2-1-6- درمان 67 2-1-7-1- اکیناسه پورپورآ (ECHINACEA PUPUREA) 70 2-1-7-1-1- گیاه شناسی 70 2-1-7-1-2- کاربرد های سنتی 71 2-1-7-1-3-اثر ضد ويروسي 72 2-1-7-1-4- اثر Echinacea puprurea (EP) بر Cythokines و Chemokines در سلول های عفونی شده با ویروس 75 2-1-7-1-5- ترشح موسین 76 2-1-7-1-6- اثر ضد باکتری 77 2-1-7-1-7- اثر ضد قارچی 77 2-1-7-1-8- خواص آنتی اکسیدان 78 2-1-7-1-9- اثر EP بر عملکرد سلول های سیستم ایمنی 78 2-1-7-1-10- مطالعه اثر اکیناسه در موش 79 2-1-7-1-11- موارد کاربرد اکیناسه در دامپزشکی 80 2-1-7-1-12- استاندارد سازی 81 2-1-7-1-2-سامباکوس نیگرا (Sambucus nigra) 82 2-1-7-1-2-1-گیاه شناسی 82 عنوان صفحه 2-1-7-21-2-2-کاربردهای سنتی 84 2-1-7-1-2-2-3-پژوهش های جدید 85 فصل سوم: مواد و روش کار 3-1- مواد و وسايل مورد نياز 90 3-1-1-عصاره ها و دارو 90 3-1-1-1- عصاره گیاهی تجاری سرخارگل (Echinaforce®) 90 3-1-1-2- عصاره گیاهی تجاری آقطی سیاه(Original Sambucol ®) 90 3-1-1-3- پودر آمانتادین هیدروکلراید (Amantadine HCL) 91 3-1-2- ويروس 91 3-1-3- ساير مواد و وسايل مورد نياز 91 3-2- روش کار 92 3-2-1- بخش اول(آزمايش in vitro) 92 3-2-1-1- تعیین حداقل دز احتمالی توکسیک دارو برای جنین 93 3-2-1-2- تعیین (NI) Neutralization Index 93 3-2-1-3- بررسي تاثير دارو بر كاهش تيتر ويروس در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار به روش HA و Real-Time PCR 94 3-2-2- بخش دوم(آزمایش های in vivo) 95 3-2-3- مراحل آزمایشگاهی 98 3-2-3-1- آزمايش هماگلوتيناسيون (Hemagglutination(HA) Test) 98 3-2-3-2- آزمايش ممانعت ازهماگلوتيناسيون (Hemagglutination Inhibition(HI) Test) 98 3-2-3-3- تهيه گلبول قرمز ماكيان(cRBC) 98 3-2-3-4- استخراج RNA 99 3-2-3-5- سنتز Cdna 101 3-2-3-6- آزمون PCR زمان حقيقي 102 عنوان صفحه 3-2-3-6-1- تعيين موارد مثبت در نمونه ها 102 3-2-3-6-2- تعيين تعداد كپي هاي قطعه M ژنوم ويروس در نمونه ها مثبت 103 3-2-3-7- تهيه پلاسميد نوتركيب 106 3-2-3-8- محاسبه تعداد نسخه پلاسميد نوتركيب 106 3-2-3-9- نرمال سازي RNA نمونه هاي مورد آزمايش 107 3-2-3-10- تجزیه و تحلیل آماری 107 فصل چهارم: نتايج 4-1- نتايج بخش اول(آزمايش in vitro) 109 4-1-1- تعیین حداقل دز توکسیک دارو برای جنین 109 4-1-2- تعیین (NI) Neuralization Index 110 4-1-3- بررسي تاثير دارو بر كاهش تيتر ويروس در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار 110 4-2- نتايج بخش دوم (آزمايش in vivo) 112 4-2-1- نتايج آزمايش سرمي HI 112 4-2-2- نتايج مربوط به ارزيابي مولكولي تيتر ويروس آنفلوآنزا 113 4-2-2-1- نمونه ها مدفوعي 114 4-2-2-2- نمونه هاي ناي 116 فصل پنجم: بحث 5-1- بخش اول(آزمايش in vitro) 118 5-2- بخش دوم(آزمايش in vivo) 122 5-3- نتیجه گیری 126 5-4- پیشنهادات 127 فهرست منابع 128 فهرست جدول‌ها عنوان صفحه جدول 1: موارد تایید شده عفونت آنفلوانزای پرندگان در انسان 9 جدول 2 – مواردی از خسارت های ناشی از اپیدمی های HPAI و LPAI بر مبنای دلار آمریکا 12 جدول 3: طبقه بندي گياه اکیناسه پورپورآ 70 جدول4: کاربرد های درمانی عصاره سرخارگل در طب سنتی 72 جدول5: میزان اثر ضد ویروسی عصاره آبی و عصاره اتانولی اکیناسه پورپورآ بر ویروس های آزمایش شده در غلظت غیر سمی برای محیط کشت سلولی 73 جدول 6- ميزان اثر آنتي باكتريال گزارش شده عصاره اكيناسه پورپورآ بر باكتري هاي مختلف 77 جدول 7 – طبقه بندي گياه Sambucus nigra Black Elderberry ، آقطی سیاه ، انگور کولی یا خمان کبیر 82 جدول 8: خلاصه روش تعيين Neutralization Index 94 جدول9: خلاصه کار بررسي تاثير عصاره ها و دارو بر تيتر ويروس در مايع آلانتوئيك تخم مرغ جنين دار ماكيان به روش HA و Real-Time PCR 95 جدول 10 : نحوه مصرف عصاره/ دارو در گروه هاي مختلف 97 جدول 11: رديف آغازگرها (Primers) و پراب(Prob) مورد استفاده در سنتز cDNA و آزمون PCR زمان حقيقي 102 جدول 12: فرمول تهيه Master Mix براي نمونه هاي مايع آلانتوئيك در آزمايش in vitro 104 جدول 13: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي نمونه هاي مايع آلانتوئيك در آزمايش in vitro 104 جدول 14: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي پلاسميد نوتركيب (استاندارد) در آزمايش in vitro 105 عنوان صفحه جدول 15: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي نمونه هاي بافتي(ناي و مدفوع) در آزمايش in vivo 105 جدول 16: فرمول تهيه مخلوط نهايي واكنش PCR زمان حقيقي براي پلاسميد نوتركيب (استاندارد) در آزمايش in vivo 105 جدول 17: نتایج تعیین حداکثر دز غیر سمی عصاره ها و دارو در مایع آلانتوئیک تخم مرغ‌های جنین دار 7 روزه 109 جدول 18 - نتایج محاسبه EID50 و (NI) Neuralization Index در بخش دوم آزمایش in vitro به منظور ارزیابی توانایی عصاره ها/دارو در مهار ویروس آنفلوانزا H9 110 جدول19- نتایج آزمون های هماگلوتیناسیون (HA) و qRT-PCR بر روی نمونه های مایع آلانتوئیک اخذ شده از تخم مرغ های جنین دار تلقیح شده با مخلوط 500 EID50 ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 و سریال رقت 2fold از Echinaforce® یا Sambucol® 111 جدول 20- نتایج تیتر متوسط آزمایش HI نمونه های سرم اخذ شده از گروه های مختلف درمان و کنترل در روزهای پس از چالش با ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 113 جدول21: نتايج آزمون PCR زمان حقيقي نمونه هاي مدفوع اخذ شده در روزهاي 3 تا 12 پس از چالش با ويروس آنفلوآنزا در گروه هاي مختلف 115 جدول 22- نتايج آزمون PCR زمان حقيقي نمونه هاي نای اخذ شده در روزهاي 3 تا 12 پس از چالش با ويروس آنفلوآنزا در گروه هاي مختلف 116 فهرست تصویرها عنوان صفحه تصویر 1- طرح شماتیک ویروس آنفلوانزا 14 تصویر 2- تفاوت های ساختاری ویروس های آنفلوانزای A وB وC 16 تصویر 3- مراحل تکثیر ویروس آنفلوانزا در سلول میزبان 26 تصویر 4- فعالیت اگزونوکلئازیDNA پلی مراز 62 تصویر5- چرخه آستانه و خط آستانه 64 تصوير 6: اکیناسه پورپورآ 70 تصوير 7 - درختچهSambucus nigra با گل های سفید 83 تصوير 8 - گل و شکوفه های سفید Sambucus nigra 83 تصوير 9 - خوشه میوه های رسیده سیاه رنگSambucus nigra 83 فهرست نمودار عنوان صفحه نمودار 1 - نتایج آزمون های هماگلوتیناسیون qRT-PCR بر روی نمونه های مایع آلانتوئیک اخذ شده از تخم مرغ های جنین دار تلقیح شده با مخلوط 500 EID50 ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 با سریال رقت 2fold از Echinaforce® یا Sambucol 112 فصل اول مقدمه و هدف ویروس آنفلوانزا تحت تیپ در کشورهای خاورمیانه از سال 1998 گزارش شده و موجب همه گیری هایی در ماکیان تجاری در عراق، عربستان سعودی، پاکستان، امارات متحده عربی، فلسطین اشغالی، ایران، اردن، کویت، لبنان و لیبی گردیده است(. (Alexander 2002, 2006 همه گیری هایی در ماکیان تجاری در ایران ( (Nili and Asasi 2002, 2003و پاکستان ( (Bano et al. 2003, Naeem et al. 1999 رخ داد. شیوع آنفلوانزای از سال 1377 در ایران سبب بروز خسارت های اقتصادی زیادی در صنعت طیور شده است. متاسفانه علی رغم تلاشهای فراوان هنوز این صنعت نتوانسته است از این بیماری رهایی یابد. به منظور کنترل بیماری آنفلوانزا ناشی از تحت تیپ در پاکستان ( (Naeem et al. 1999، ایران ( (Vasfi Marandi et al. 2002 و چین ( (Liu et al. 2002واکسن کشته مورد استفاده قرار می گیرد. اما علی رغم به کار گیری واکسن، به نظر می رسد که عفونت در طیور تجاری بسیاری از کشورها به صورت بومی در آمده است. دو گروه از داروهای ضد ویروسی برای درمان و پروفیلاکسی آنفلوانزا در انسان موجود می باشد: مهار کننده های M2 (amantadine و rimantadine ) و مهار کننده های نورآمینیداز (oseltamivir و zanamivir ). علی رغم تاثیر این داروها بر کاهش مرگ و میر و واگیری آنفلوانزا در انسان، بروز مقاومت دارویی مهمترین عامل محدود کننده در استفاده از این دارو ها می باشد. بروز مقاومت در برابر داروهای مهار کننده M2 همراه با بروز گسترده تر آنفلوانزای فصلی، احتمالا" به دلیل استفاده وسیع تر از داروها، بیشترشده است(Bright et al. 2005). مقاومت در برابر داروهای مهار کننده نورآمینیداز کمتر گزارش شده و در نتیجه گزینه بهتری برای مقابله با پاندمی آنفلوانزا می باشند. با این وجود گزارش های جدید در مورد ویروس های مقاوم به oseltamivir سبب افزایش نگرانی برای مقابله با پاندمی آنفلوانزا گردیده است (Regoes and Bonhoeffer 2006 Moscona et al. 2005,). در حال حاضر هیچ درمان اختصاصی و عملی برای عفونت های ناشی از ویروس های آنفلوانزا در پرندگان وجود ندارد. نشان داده شده که آمانتادین به صورت تجربی در کاهش مرگ و میر موثر بوده است (Easterday et al. 1997 , Lang et al. 1970, Webster et al. 1985, Beard et al. 1987, Dolin et al. 1982 ). اما این دارو برای حیواناتی که مورد استفاده انسان قرار می گیرند، به دلیل افزایش مقاومت ویروسها نسبت به آمانتادین، توصیه نمی شود. درمان های حمایتی و استفاده از آنتی بیوتیک ها به منظور کاهش اثرات عفونت های باکتریایی همزمان، توصیه می شوند. استفاده از داروهای آنفلوانزای انسانی در طیور، به شدت منع شده است( (Stone et al. 1997. در سال های اخیر تلاش های زیادی به منظور بررسی اثر درمانی گیاهان دارویی بر عفونت های ویروسی و به خصوص ویروس آنفلوآنزا صورت گرفته است. بیشتر این کارهای پژوهشی در شرایط کشت سلولی و موارد انسانی می باشند . هرچند برخی از این عصاره ها به تنهایی و یا همراه با عصاره گیاهان دیگر به صورت تجاری توسط شرکت های مختلف تولید و در بازاركشورهاي مختلف و از جمله اروپا و آمریکای شمالی به عنوان داروی انسانی عرضه می شوند. از جمله شناخته شده ترین گیاهان برای مقابله با سرماخوردگی و آنفلوانزای انسانی Echinacea purpurea و Sambucus nigra می باشند. عصاره این دو گیاه به صورت تنها یا همراه با سایر عصاره های گیاهی با نام های تجاری گوناگون در داروخانه ها وجود دارد. همچنین عصاره Echinacea purpurea توسط برخی از شرکت های داخلی و خارجی برای مصرف در مزارع طیور عرضه می شود. هدف از این طرح بررسی جامع اثر عصاره های استاندارد Echinacea purpureaو Sambucus nigra در شرایط کنترل شده in vitro و in vivo بر عفونت ویروس آنفلوانزای پرندگان H9N2 در مایع آلانتوئیک تخم مرغ های جنین دار و دفع ویروس در ماکیان صنعتی گوشتی می باشد. فصل دوم کلیات 2-1- آنفلوانزا 2-1-1- تاریخچه همه گیری های آنفلوانزای خفیف پرندگان در اثر تحت تیپ اطلاعات اپیدمیولوژیک نشان می دهد که ویروس های آنفلوانزا تحت تیپ در تمام کشورها وجود دارند. در آمریکای شمالی، اولین بار در سال 1966، تحت تیپ از بوقلمون ها جدا شد(Homme and Easterday 1998). عفونت بوقلمون ها به ویروس آنفلوانزای معمولا موجب علائم خفیف می شود اما برخی همه گیری ها بسیار شدید هستند و موجب درگیری بالا، اسهال، خمودگی و کاهش تولید تخم می شوند (.(McCapes et al 1986 در ایالات متحده ، 16 همه گیری در ارتباط با تحت تیپ در بوقلمون ها بین سال های 1981 و 1996 گزارش شده است ((Halvorson et al 1991. از سال 1976 تا 1990 ، از اردکهای وحشی سالم در آلبرتا ، کانادا ، ویروس های آنفلوانزای H9 جدا شدند (1997. (Sharp et al. ویروس های آنفلوانزای H9 در پرندگان دریایی بیش از اردکهای وحشی در آمریکا شیوع داشتند (.(Kawaoka et al. 1998 در سال های 1995 تا 1998 ، 16 درصد جدایه ها از پرندگان آبزی ویروس های H9 بوده اند (Unpublished data) . در اروپا بین سال های 1977 تا 1989 ویروس های آنفلوانزا تحت تیپ H9 N2 که از پرندگان آبزی جدا شدند، میزان کمی را به خود اختصاص دادند (کمتر از یک درصد جدایه ها). همچنین این ویروس ها از پرندگان اهلی شامل بوقلمون، ماکیان، قرقاول و اردک های اهلی بین سال های 1995 تا 1997 جدا شدند ((Alexander 1997. ویروس های آنفلونزای H9 N2 در آسیا، از سال 1975 تا 1985 تنها از اردک های به ظاهر سالم در پرنده فروشی ها جدا شدند ( (Shortridge 1992. سپس ویروس های H9 N2 در پرندگان اهلی چین شیوع پیدا کرد و انتقال این ویروس از پرندگان به پستانداران نیز در این منطقه رخ داد. عفونت با ویروس های آنفلوانزای با بیماری زایی خفیف در پرندگان تجاری، به خصوص ماکیان، از اواسط دهه 1990 در بسیاری از کشورها گزارش شده است. همه گیری هایی در اثر این ویروس در اردکهای اهلی، ماکیان و بوقلمونهای کشور آلمان بین سال های 1997-1995 ، 1998 و2004( (Werner 1998, 1999و ماکیان کشور ایتالیا در سال های 1994 و 1996 ((Fioretti et al. 1998 رخ داد. قرقاول های ایرلند در سال 1997 ((Campdell et al. 1998 ، شتر مرغ های آفریقای جنوبی در سال 1995 ( (Banks et al. 2000 و بوقلمون های ایالات متحده در سال های 1995 و 1996 ( (Halvorson et al. 1998 به این ویروس مبتلا شدند. ابتلا ماکیان به ویروسهای در کره، اولین بار در سال1996 گزارش شد ( (Mo et al. 1997, Lee et al. 2000. همه گیری هایی در اثر ویروس آنفلوانزا تحت تیپ در چین در سال 1994 رخ داد(. (Yingjie et al. 1998 گزارش های بعدی در ارتباط با انتشار بیماری آنفلوانزا در اثر ویروس های در چین و هنگ کنگ بود (. (Guan et al. 2000, Liu et al 2003 a, b, c ویروس آنفلوانزا تحت تیپ در کشورهای خاورمیانه از سال 1998 گزارش شده و موجب همه گیری هایی در ماکیان تجاری عراق، عربستان سعودی، پاکستان، امارات متحده عربی، فلسطین اشغالی، ایران، اردن، کویت، لبنان و لیبی گردیده است(. (Alexander 2002, 2006 همه گیری هایی در ماکیان تجاری در ایران ( (Nili and Asasi 2002, 2003و پاکستان ( (Bano et al. 2003, Naeem et al. 1999 رخ داد. پس از واگیری صنعت طیور کشور ما به آنفلوانزا درسال 1377 ، این صنعت متحمل خسارات اقتصادی سنگینی گشت. متاسفانه علی رغم تلاشهای فراوان هنوز این صنعت نتوانسته است از این بیماری رهایی یابد. به منظور کنترل بیماری آنفلوانزا ناشی از تحت تیپ در پاکستان ( (Naeem et al. 1999، ایران ( (Vasfi Marandi et al. 2002 و چین ( (Liu et al. 2002واکسن کشته مورد استفاده قرار می گیرد. اما با وجود بر این به نظر می رسد که عفونت در طیور تجاری بسیاری از کشورها به صورت بومی در آمده است. تغییرات آنتی ژنی سریع این ویروس و ظهور سویه های با حدت بالاتر از سویه های مادری در نقاط مختلف جهان گزارش شده است . تغییرات و نوع اسید های آمینه در محل شکسته شدن پروتئین HA یکی از مهمترین عوامل تاثیرگذار در حدت ویروس آنفلوانزا می باشد (Steinhauer et al. 1999). 2-1-2- اهمیت بیماری از نظر بهداشت عمومی به طور کلی ویروس های آنفلوانزا به گونه های میزبانی خاصی عادت پیدا می کنند و انتقال در بین افراد یک گونه صورت می گیرد . ولی گاهی انتقال بین گونه های نزدیک نیز رخ می دهد. در موارد نادری انتقال ویروس های آنفلوانزای پرندگان به انسان مشاهده شده است ( (Swayne et al. 2000. انتقال ویروس های آنفلوانزای پرندگان به انسان از 2 راه مجزا ممکن است رخ دهد: - انتقال ژنوم کامل ویروس آنفلوانزای پرندگان - انتقال قطعاتی از ژن ویروس آنفلوانزای پرندگان 2-1-2-1- انتقال ژنوم کامل ویروس آنفلوانزای پرندگان ویروس های آنفلوانزای پرندگان به استیل نورامینیک اسید- 2و3 - گالاکتوز و ویروس های آنفلوانزای انسانی و خوک به استیل نورا مینیک اسید- 2 و6 - گالاکتوز بر روی رسپتور های سیا لو الیگو ساکارید متصل می شوند (Ito et al. 1998). اپتیلیوم دستگاه تنفس پرندگان دارای گیرنده استیل نورامینیک اسید- 2 و 3 – گالاکتوز ، اپتیلیوم دستگاه تنفس انسان دارای گیرنده استیل نورامینیک اسید- 2 و 6 – گالاکتوز و اپتیلوم دستگاه تنفس خوک دارای هر دو گیرنده می باشد (Ito et al. 1998). بنابراین این نکته ممکن است توضیح دهنده این امر باشد که چرا تعداد موارد ابتلای انسان به ویروس های آنفلوانزای خوک بیشتر از موارد ابتلای انسان به ویروس های آنفلوانزای پرندگان می باشد. با این وجود در سلولهای قسمتهای عمقی دستگاه تنفس انسان (سلولهای مکعبی بدون مژه برونشها و سلولهای آلوئولی تیپ دو) گیرنده های استیل نورامینیک اسید- 2و3 – گالاکتوز وجود دارد و مکان مناسبی برای تکثیر ویروسهای آنفلوانزای پرندگان ایجاد میکنند(Shinya et al. 2006). اما قرار گرفتن آنها در قسمتهای عمقی دستگاه تنفس ، موجب میشود که موارد ابتلا انسان به ویروس آنفلوانزای پرندگان ، نادر باشد. به علاوه، سایر ژنهای ویروس آنفلوانزای پرندگان مانند کمپلکس پلی مراز ممکن است موجب تکثیر ناکارآمد ویروس در انسان شوند (Shinya et al. 2006). اگر چه به نظر می رسید ویروس های دخیل در پاندمی های انسانی در سالهای 1957و 1968 در اثر نوترکیبی بین ویروس های آنفلوانزای موجود در جمعیت انسانی و ویروس های آنفلوانزای پرندگان ایجاد شده اند (Schlotissek et al. 1978, Kawaoka et al. 1989) ، اما تا کنون عفونت مستقیم انسان به ویروس های آنفلوانزای پرندگان به عنوان یک بیماری زئونوز مهم مورد توجه قرار نگرفته است. از سال 1959 میلادی موارد متعددی از جدا سازی ویروس های آنفلوانزای پرندگان از انسان به ثبت رسیده است (جدول 1). در موارد ابتلای انسان به ویروس آنفلوانزای پرندگان التهاب ملتحمه چشم (دراغلب موارد ابتلا به ویروسهای H7) ، بیماری تنفسی (دراغلب موارد ابتلا به ویروسهای H5 ) یا علائم شبیه آنفلوانزا مشاهده شده است. اما در برخی موارد علایم گوارشی نیز گزارش شده است(WHO, 2005). ابتلای انسان به ویروس های آنفلوانزای پرندگان به نظر نادر می رسد. به طوری که نشان داده شده زمانی که انسان با برخی از ویروس های آنفلوانزا با منشاء پرندگان آلوده شده ، تنها یک عفونت موقتی ظاهر شده است (Webster and Beare 1991). موارد ابتلا انسان به ویروس بسیار بیماریزای H5N1 در مناطق جغرافیایی وسیعی از جمله کشورهای آذربایجان، کامبوج، هنگ کنگ ، چین، مصر، اندونزی، عراق، تایلند، ترکیه و ویتنام گزارش شده است. اغلب این موارد در اثر تماس مستقیم با پرندگان آلوده به ویروسهای H5N1 در روستاها یا پرنده فروشی ها، رخ داده است (Shinya et al. 2006, Perdue et al. 1999). موارد ابتلای انسان به ویروس های آنفلوانزای پرندگان از سال 1959 تا 2012 در جدول 1 آمده است. جدول 1: موارد تایید شده عفونت آنفلوانزای پرندگان در انسان(Swayne et al., 2013). در زمان تکمیل این جدول در سال 2013 یک مورد عفونت ویروس آنفلوانزا LPAI H7N8 با منشاء بازار فروش پرنده های زنده (LPM) سبب بروز بیماری شدید در انسان شد. . 2-1-2-2- انتقال قطعات ژن ویروس آنفلوانزای پرندگان پرندگان آبزی، مخزن تمام ژنهای ویروسهای آنفلوانزا هستند(Webster et al. 1992). اگر چه احتمال ورود ویروس آنفلوانزای پرندگان به جمعیت انسانی وجود دارد، باز آرایی و ایجاد دودمانهای جدید ویروس آنفلوانزا در انسان نادر است (Alexander and Banks 1998). آنالیز توالی نوکلئوتیدهای پاندمی های در سال 1957 و در سال 1968نشان داد که این ویروسهای آنفلوانزا به ترتیب از باز آرایی سه ژن ، ، و دو ژن و ویروسهای آنفلوانزا ی طیور با 5 و 6 ژن ویروسهای آنفلوانزای انسانی ایجاد شده اند (Schafer et al. 1995, Webster and Kawaoka 1989, Taubenberger and Reid 1999, Scholtissek et al. 1978). خوک به عنوان Mixing vessel در انتقال ویروسهای آنفلوانزا با ایجاد سویه های جدید، از پرندگان به پستانداران فرض می شود و می تواند انسان و سایر پستانداران را آلوده سازد (Naylar and Scholtssek 1988). با وجود این ، در عفونت انسان به ویروس بیماریزای و عدم وجود ابتلا به ویروسهای و در خوک در پاندمی سالهای 1957 و 1968 ، باز آرایی قطعات ژن بین ویروس آنفلوانزای پرندگان در انسانهای آلوده شده به هر دو ویروس میتواند رخ داده باشد (Seif et al. 2008). همچنین مواردی از تبادل قطعات ﮊنوم آنفلوانزای H9N2 با تحت تیپهای HP H7N3 و HP در پاکستان(Iqbal et al. 2009) و H9N2با ﮊن های داخلی H5N1 جدا شده از انسان ، در چین (Zhang et al. 2009) گزارش شده است. 2-1-2-3- انتقال ویروس H9 N2 به انسان طی یک پژوهش گذشته نگر ویروسی در بازه زمانی مارس 1998 و ژوئن 2000 در هنگ کنگ در خوک های وارد شده از جنوب چین، برای اولین بار انتقال بین گونه ایی ویروس های H9N2 پرندگان به خوک نشان داده شد. همچنین بروز همزمان عفونت با ویروس H3N2 انسانی و H9N2 پرندگان در خوک گزارش شد. در خوک به عنوان میزبان واسط، در صورت ابتلای همزمان به ویروس های آنفلوانزای پرندگان و انسان، این امکان وجود دارد که از طریق نوترکیبی ژنتیکی یا تطابق ، ویروس های پاندمی آنفلوانزا ظهور پیدا کند (Peiris et al., 2001) ویروس های H9 N2 از 5 بیمار مبتلا به علائم شبیه آنفلوانزا در چین در سال 1999 جداسازی شد (Guo et al. 1999) در مارس 1999 ، دو مورد آنفلوانزای خفیف در انسان در هنگ کنگ گزارش داده شد و نشان داده شد که عفونت در اثر ابتلا به ویروس های H9 N2 بوده است (Anno et al. 1999, Peiris et al. 1999). دو ویروس جدا شده از کودکان در هنگ کنگ (در طی همه گیری H5N1 ) از نظر ژنتیکی و آنتی ژنیکی بسیار به ویروس H9 N2 بلدرچین مشابه بودند (Lin et al. 2000, Guan et al. 1999). در پاکستان، ویروس های H9 N2 جداشده از پرندگان تجاری دارای ارتباط نزدیک با ویروس های انتقال یافته به انسان در هنگ کنگ بودند (Cameron et al. 2000). با توجه به موارد ذکر شده به نظر می رسد ویروس های آنفلوانزای H9 N2 یکی دیگر از کاندیداهای پاندمی بعدی در دنیا باشند و می توانند به عنوان دهنده کمپلکس ژنهای تکثیری به ویروس های بسیار بیماری زا از جمله H5 و H7 باشند.